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{{百科小图片|bka1y.jpg|PCR流程}} '''聚合酶链式反应'''(Polymerase Chain Reaction),简称'''PCR''',是一种[[分子]][[生物学]]技术,用于放大特定的[[DNA]]片段。可看作生物体外的特殊[[DNA]]复制。 {{百科小图片|PCR技术.gif|PCR技术}} ==PCR原理== DNA的[[半保留复制]]是生物进化和[[传代]]的重要途径。双链DNA在多种[[酶]]的作用下可以变性解链成单链,在[[DNA聚合酶]]的参与下,根据[[碱基]]互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以[[复性]]成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,加入设计[[引物]],DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 但是,[[DNA聚合酶]]在高温时会[[失活]],因此,每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不仅操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展。 发现耐热[[DNA聚合酶]]--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的[[寡核苷酸]]引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成: ①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR[[扩增]]形成的双链DNA[[解离]],使之成为[[单链]],以便它与引物结合,为下轮反应作准备; ②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合; ③引物的延伸:DNA模板--引物[[结合物]]在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的[[基因扩增]]放大几百万倍。 {{百科小图片|PCR原理.jpg|PCR原理}} ==PCR步骤== <b>标准的PCR过程分为三步</b>: 1.DNA变性(90℃-96℃):双链DNA模板在热作用下, 氢键断裂,形成单链DNA 2.退火(25℃-65℃):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。 3.延伸(70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右,活性最佳)的作用下,以dNTP为原料,从引物的5′端→3′端延伸,合成与模板互补的DNA链。 每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量即增加一倍。如图所示: 现在有些PCR因为扩增区很短,即使Taq[[酶活性]]不是最佳也能在很短的时间内复制完成,因此可以改为两步法,即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行,以减少一次升降温过程,提高了反应速度。 ==PCR反应特点== (1)特异性强 PCR反应的特异性决定因素为: ①引物与模板DNA特异正确的结合; ②[[碱基配对]]原则; ③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性; ④靶基因的特异性与保守性。 其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性,使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行,结合的特异性大大增加,被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶[[基因区]],其特异性程度就更高。 (2)灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(μg=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个[[靶细胞]];在病毒的检测中,PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位);在细菌学中最小检出率为3个细菌。 (3)简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应,一般在2~4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析,不一定要用[[同位素]],无[[放射性]]污染、易推广。 (4)对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。 ==PCR的循环参数== 1、预变性(Initial denaturation):模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要,建议加热时间参考[[试剂]]说明书,一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。 2、循环中的变性步骤:循环中一般95℃,30秒足以使各种靶DNA序列完全变性,可能的情况下可 缩短该步骤时间。变性时间过长损害酶活性,过短靶序列变性不彻底,易造成扩增失败。 3、引物退火(Primer annealing):退火温度需要从多方面去决定,一般根据引物的Tm值为参考,根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。 4、引物延伸:引物延伸一般在72℃进行(Taq酶最适温度)。但在扩增长度较短且退火温度较高时,本步骤可省略。延伸时间随扩增片段长短而定,一般推荐在1000bp以上,含Pfu及其[[衍生物]]的衍生设定为1min/kbp。 5、循环数:大多数PCR含25-40循环,过多易产生非特异扩增。 6、最后延伸:在最后一个循环后,反应在72℃维持5-15分钟.使引物延伸完全,并使单链产物退火成双链。 {{百科小图片|PCR仪器.jpg|PCR仪器}} ==PCR学习视频== ==参看== *[[DNA]] *[[基因]] *[[DNA聚合酶]] [[分类:生物]][[分类:生物学]] [[分类:医学视频]]
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