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临床生物化学/连续监测法中的干扰因素及其控制
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{{Hierarchy header}} 大多数测定[[标本]]不是纯酶制剂,而是体液或[[组织液]]。其中除了测定酶外,还存在着其它酶和各种物质,如使用酶[[偶联]]反应,在反应体系中又外添了大量的各种酶制剂,因此在反应体系中可能出现一些我们不希望的[[副反应]]或旁路反应,这些都有可能对测定反应产生干扰。 (一)其它酶和物质的干扰 如组织[[匀浆]]中往往含有NADH-[[细胞色素C]][[还原酶]],它将干扰各种还原酶的测定。临床酶测定中最典型的例子是[[血液]]中[[丙酮]]酸对[[丙氨酸氨基转移酶]]测定的干扰,由于反应体系中含有大量[[乳酸脱氢酶]]和NADH,可与丙酮酸反应消耗NADH,引起340nm处吸亮度下降,假如将此NADH下降也算为[[ALT]]活性将引起误差。其它如[[红细胞]]中[[腺苷酸激酶]](AK)对[[CK]]测定的干扰,在CK的酶偶联体系中ADP是CK[[底物]],但它又同时是AK的底物,二个[[酶反应]]都产生[[ATP]],在工具酶([[已糖]][[激酶]]和6-[[磷酸葡萄糖脱氢酶]])作用下都产生NADH引起340nm处吸光度上升,其结果是CK测定结果偏高,为避免此种干扰,所以在反应体系中加入AK的[[抑制剂]]AMP和二[[腺苷酸]]5′[[磷酸]]。 (二)工具酶的污染 目前[[试剂]]中所用的试剂酶多从动物组织或[[细菌]]中提取,不可避免地会污染有其它酶,如不注意此问题,会引起不正确结果,例如丙酮酸[[羧化酶]][[催化]]下列反应: {{图片|goqr7r61.jpg|}} 可加入[[苹果]]酸[[脱氢酶]]和NADH进行测定,将[[草酰乙酸]]转变为苹果酸,并将NADH转变为NAP<sup>+</sup>。如果工具酶苹果酸脱氢酶不纯,含有乳酸脱氢酶,也可以作用底物之一的丙酮酸,同时消耗NADH,这样就无法准确测定丙酮酸羧化酶活性。 更有甚者,有些工具酶中就混有测定酶,这种情况下,将产生很高的[[本底]]。 所以所用的工具酶必须很纯,并检查污染酶的含量,例如测定[[天冬氨酸]][[氨基转移酶]]所用的苹果酸脱氢酶中所含杂的[[AST]]时,按IFCC规定不应超过0.005%。 (三)非酶反应 有些底物不稳定,没有酶的作用就能自行反应,例如[[ALP]]的底物磷酸对硝基酚配成的底物溶液,室温放置过夜,即自行水解释放出对硝基成黄色。又如测[[醛缩酶]]时,其底物醛类化合物可以和NAD<sup>+</sup>起非酶反应产生一种具有类似NADH吸收光谱的[[化合物]],给测定带来困难。 (四)分析容器的污染 如冲洗不当,分析容器和管道中混杂有各种物质,可能影响[[酶活性]],如微量重金属可使酶[[失活]],残留的[[表面活性剂]]可能抑制酶活性。 (五)沉淀形成 使用光学法监测酶反应时,如有沉淀形成或组织匀浆中颗粒的下沉都会引起吸光度变化,引起测定结果误差,此情况常见于底物溶解度低而反应体系中底物浓度偏高。可见于用γ-谷氨酰[[对硝基苯胺]]为底物测GGT时。 对上述的一些问题常可通过试剂空白管检出并加以校正。不同厂家的ALT,AST[[试剂盒]]由于杂酶存在,试剂空白管可以测出多少不等[[转氨酶]]活性,个别可达5U/L以上,这种试剂无法使用,较好的试剂盒也在2U/L左右。如不作试剂空白管对结果加以校正,所测结果将偏高,用半自动分析仪测定酶时特别要注意作试剂空白管,有时还需作标本对照管,例如测ALT时为除去GLD的干扰,可以在底物溶液中不加入[[丙氨酸]],与标本中GLD作用引起NADH下降。 解决这些问题另一个有效措施就是不用单一试剂测酶活性,改用双试剂,先加的第一试剂常不含底物或底物之一,但含有所有其它成分,与标本作用一段时间待吸光度停止变化后,再加入底物开始测定酶的反应。 {{Hierarchy footer}} {{临床生物化学图书专题}}
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