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{{百科小图片|bkabr.jpg|}} [[多聚酶链式反应]](PCR):一种体外[[扩增]]DNA的方法。PCR使用一种耐热的[[多聚酶]],以及两个含有20个[[碱基]]的[[单链]][[引物]]。经过高温变性将模板DNA分离成两条链,[[低温]]退火使得引物和一条模板单链结合,然后是中温延伸,反应液的[[游离核]]苷酸紧接着引物从5‘端到3’端合成一条互补的新链。而新合成的DNA又可以继续进行上述循环,因此DNA的数目不断倍增。 多聚酶链式反应( PCR) [[基因扩增]]及[[琼脂糖凝胶电泳]]检测 来源:不详 收集整理:21世纪生物网站 ==实验目的== 通过本实验学习PCR反应的基本原理,掌握PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。 ==实验原理== PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段,即通过[[引物延伸]]而进行的重复双向DNA合成。基本原理及过程如下: PCR循环过程中有三种不同的事件发生:(1)模板变性;(2)引物退火;(3)热稳定DNA[[聚合酶]]进行DNA合成。 1. 变性:加热使模板DNA在高温下(94-95℃)变性,双链间的氢键断裂而形成两条单链,即变性阶段。 2. 退火:在体系温度降至37-65℃,模板DNA与引物按[[碱基配对]]原则互补结合,使引物与[[模板链]]3’端结合,形成部分双链DNA,即退火阶段。 3. 延伸:体系反应温度升至中温72℃,耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板,在引物的引导下,利用反应混合物中的4种[[脱氧核苷]]三磷酸(dNTP),按5’到3’方向复制出互补DNA,即引物的延伸阶段。 上述3步为一个循环,即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲,每经过一个循环,样本中的DNA量应该增加一倍,新形成的链又可成为新一轮循环的模板,经过25~30个循环后DNA可扩增106~109倍(应该是十的六次至十的九次,是百度无法打出科学计数法,因此写成了106~109)。 典型的PCR反应体系由如下组分组成:DNA模板、反应[[缓冲液]]、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。 ==琼脂糖凝胶电泳原理== 琼脂糖凝胶电泳的原理:[[琼脂糖]]是一种天然聚合长链状[[分子]],沸水中溶解,45℃开始形成多孔性刚性滤孔,[[凝胶]]孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应。不同DNA,其分子量大小及[[构型]]不同,电泳时的泳动率就不同,从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA,主要是利用分子筛效应,迁移速度与分子量的对数值成反比关系。溴化乙锭(EB)为扁平状分子,在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA[[复合物]],其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上,且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察,可检测到5 ng以上的DNA。 ==实验材料及相关[[试剂]]== [[基因组]]DNA,[[基因]]特异性引物,PCR扩增相关试剂,等 ==实验步骤== 1.模板DNA的抽提:实验一所得的水稻基因组DNA。 2.PCR操作 (在冰上操作): (1)PCR反应混合液的配制:反应体系25 µL, 在[[无菌]]的0.2 mL[[离心管]]中按下列操作程序加样: (2)将反应混合液混匀, 然后每个PCR管中分装24 µL反应混合液,再加1 µL模板DNA,最后加1滴[[石蜡油]],防止水分[[蒸发]], 然后稍离心。 (3)将PCR管放到PCR热循环仪中,按下列程序开始循环: (4)注意事项 由于PCR灵敏度非常高,所以应当采取措施以防反应混合物受痕量DNA的污染。 a. 所有与PCR有关的试剂,只作PCR实验用,而不挪作它用。 b. 操作中所用的PCR管、离心管、吸管头等都只能一次性使用。 c. 每加一种反应物,应换新的枪头(加样器的塑料吸嘴的俗称)。 3.PCR产物的检测: 琼脂糖浓度(1.2%);EB浓度(5 µl / 100 ml TBE) (1)制胶(以150 mL为例) a. 称取1.8 g 琼脂糖,加入150 ml 的TBE缓冲液(pH 8.0),摇匀,用电子[[天平]]称三角瓶的总重量。 b. 电炉上加热,至琼脂糖完全溶解;然后在天平上加[[蒸馏水]]至原重量; c. 用凝胶将制胶板两端封好,插入适当的梳子,将溶解的琼脂糖(约50℃),倒入其中,直至厚度为4~6 mm(如有气泡要把气泡赶出),在室温下冷却凝固(约30~ 45 min); d.将制胶板置于电泳槽中,小心垂直向上拔出梳子,以保证点样孔完好。 (2)点样 a. 将2.0 µl 溴酚蓝加入到PCR产物中,然后稍微离心; b. 每孔点样10.0 µl,蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。 (3)电泳 打开电源开关,调节电压至3~5 V/cm(约100 V),可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动,约1小时后即可观察。 (4)[[染色]] 将电泳好的凝胶放入含EB的水溶液中, 染色15-20分钟。 (5)观察 将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上,戴上防护观察罩,打开[[紫外灯]],可见到橙红色[[核酸]]条带,根据条带粗细,可粗略估计该样品DNA的浓度。如同时有已知分子量的标准DNA进行电泳,则可通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。 (6)注意事项 a. 煮胶时,胶液的量不应超过三角瓶容量的1/3,否则易溢出。 b. 煮好的胶应冷却至50℃左右时再倒,以免制胶板变形,并减少漏胶的机会。 c. 倒胶注意厚度(4-6 mm),充分凝固后再拔出梳子,以保持齿孔形状完好。也可待胶稍凝固后,放入4℃冰箱10多分钟,以加速胶的凝固。 d. 加样前赶走点样孔中的气泡,点样时吸管头垂直,切勿碰坏凝胶孔壁,以免使带型不整齐。 e. 一般情况下不必每点一个样品都换枪头,吸电泳缓冲液洗几次即可再点下一个样品。凝胶中含有EB,切勿直接用手接触胶,废弃胶应集中处理,勿乱丢。 [[分类:分子生物学]][[分类:分子学]]
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