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临床生物化学/探针制备
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{{Hierarchy header}} [[探针]]制备就是目的[[基因]]的标记,[[核酸]]标记方法常用的有缺口平移法、随机[[引物]]法、[[末端标记]]法等。[[标记物]]质有[[放射性]]元素(如<sup>32</sup>P等)和非[[放射性物质]](如[[生物素]]、[[地高辛]]等)。<sup>32</sup>P是最常用的[[核苷酸]]标记[[同位素]],被标记的dNTP本身就带有[[磷酸基]]团,便于标记,特点是比活性高,可达9000Ci/mmol;发射的β[[射线]]能量高,可达1.70MeV,用它标记的探针自显影时间短,灵敏度高。<sup>32</sup>P的半寿期为14天,应随标随用,一般标记后,在一周内使用,它虽带来不便,但给使用后废弃物处理减轻了压力。使用<sup>32</sup>P标记物应注意防护,操作时应有1-1.5cm厚[[聚甲基丙烯酸甲酯]]有机玻璃[[隔离]]保护,避免直接照射。操作人员胸前应佩带个人计量器,定期检测。结束实验后,应用专用探测器(盖革-米勒检测器),检查工作区域、手、衣服等,以免污染发生。其它[[同位素标记]]物,同样应注意[[放射线]]防护。 非[[放射性标记]]有酶标和化学物标记法。酶标方法与[[免疫]]测定ELISA方法相似,只是被标记的核酸代替了被标记的[[抗体]],事实上被标记的抗体也称为探针,阅读文献时应加以注意。现有许多商品是生物素(biotin)、地高辛标记的,如生物素-dUTP、生物素-dATP、地高辛-dUTP等。[[血凝素]](avidin)与生物素有非常高的亲和性,当血凝素标记上[[过氧化物酶]]或[[碱性磷酸酶]](血凝素-酶),经[[杂交反应]]最终形成:探针-生物素-血凝素-酶[[复合物]](ABC法)。酶[[催化]][[底物]]显色,观察结果。与一般的[[酶反应]]底物不同,ABC法底物显色后为不溶物,以便观测结果。[[酶标记]]法复杂、重复性差、成本高,但便于运输保存,灵敏度与放射物标记相当。化学物标记有的也是利用相应酶标抗体形成特异复合物,与上述方法相当,有的则可自发光。[[化学]]标记法简单、成本低,但灵敏度相对较低。(表18-1) 表18-1 探针标记及特性 {| class="wikitable" | 标记物 | 检测方法 | 特点 |- | <sup>32</sup>P | β射线,自显影 | 灵敏度最高,半寿期14天,放射强度1.7MeV |- | <sup>35</sup>S | β射线,自显影 | 灵敏度高,分辨率好,半寿期87天,0.17MeV |- | <sup>3</sup>H | β射线,自显影 | 低敏度高,分辨率高,半寿期12年,0.01MeV |- | <sup>125</sup>I | γ射线,自显影 | 灵敏度高,分辨率高,半寿期60天,0.04MeV |- | 生物素 | 酶标血凝素,显色 | 灵敏度好,避免有内源性生物素[[标本]] |- | 地高辛 | 酶标地高辛[[配体]],显色 | 灵敏度好,分辨率一般 |- | T-T[[二聚体]] | 酶标抗二聚体抗体,显色 | 灵敏度好,紫外照射形成二聚体而标记 |- | BrdU | 酶标抗BrdU抗体,显色 | 灵敏度好,[[细菌]]内含[[质粒]]复制掺入 |- | 铕-[[补骨脂素]] | 荧光 | 灵敏度一般 |} [[缺口平移]]标记法先由DNase Ⅰ在[[DNA]]双链上切出随机切口,DNA[[聚合酶]]Ⅰ沿缺口水解5′端核苷酸和3′端修复加入被标记核苷酸同时进行,切口平行推移,可均一标记DNA链。(图18-4、5) 缺口平移法快速、简便、成本相对较低、比活性较高、标记均一。主要利用了DNA聚合酶Ⅰ修复DNA的功能,用于大分子DNA标记(>1000bp最好),[[单链DNA]]、[[RNA]]不能用该法标记。随机引物法具有上述优点,可代替缺口平移法。此外大小、单双DNA均可标记,标记均匀,标记率高,但不能标记环状DNA。利用[[末端转移酶]]可进行“尾标”,尾标适用于[[寡核苷酸探针]]标记,用于大分子核酸标记因尾巴短而标记比活性降低。尾标不能用dTTP标记,因mRNA的多聚(A)尾而影响杂交特异性。寡核苷酸探针多用于核酸“点”[[突变]]检测,该探针可用核酸合成仪人工合成。克隆探针一般较长,特异性 {{图片|gor4usrj.jpg|DNA随机引物标记法}} 图18-5 DNA随机引物标记法 好,标记量大,杂交检出信号强。合成探针长度短,一般在20-50核苷酸之间,过长合成成本高,且易出现聚合酶合成错误,杂交时间长。太短则特异性下降。合成探针设计还应注意[[碱基组成]]G≡C含40%-60%,一种[[碱基]]连续重复不超过4个,以免非特异性杂交产生。还要注意探针自身序列内应无互补区域以免产生“发夹”结构,影响杂交。一个好的探针最终在实践中才能加以确认。另外,还有利用M13[[噬菌体]]载体可复制单链DNA的特点,复制合成DNA探针,利用[[转录]]载体(DNA),转录合成RNA探针。下面就GIBCoBRL公司(Bethesda Research Laboratories美国)的缺口平移法标记生物素[[试剂盒]](bionick labeling system)为例介绍如下: {| class="wikitable" | [[试剂]]: | 10x dNTP Mix.250μl | 10x Enzyme Mix 250μl |- | | 0.2mmol/L each dCTP,dCTP,dTTP | 0.5 units/μl DNA Polymerase Ⅰ |- | | 0.1mmol/L dATP | 0.0075 units/μl DNase Ⅰ |- | | 0.1mmol/L biotin-14-dATP | 50mmol/L Tris-HCl(pH7.5) |- | | 500mmol/L Tris-HCl(pH7.8) | 5mmol/L magnesium acetate |- | | 50mmol/L MgCl<sub>2</sub> | 1mmol/L β-mercaptoethanol |- | | 100mmol/L β-mercaptoethanol | 0.1mmol/L phenylmethyl- |- | | | sulfonyl fluoride |- | | | |- | | 100μg/ml nuclease-free BSA | 50%(v/v)glycerol |- | | | 100μg/ml nuclease-free BSA |- | | Control DNA:5μg pBR322 in TE | |- | | stop buffer 300 mM EDTA | |- | | autoclaved H<sub>2</sub>O | |} 操作步骤: 将5μl 10x dNTP Mix.;-μl DNA(相当1μg需标记的DNA量);-μl[[灭菌]][[蒸馏水]]加至45μl;再加5μl10x Enzyme Mix.依次加入1.5-2ml[[离心管]]后。15000xg离心15秒钟。16℃保温1小时。加5μl Stop Buffer终止反应。[[乙醇]]沉淀,备用。 {{Hierarchy footer}} {{临床生物化学图书专题}}
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