匿名
未登录
创建账户
登录
医学百科
搜索
查看“原代培养”的源代码
来自医学百科
名字空间
页面
讨论
更多
更多
语言
页面选项
Read
查看源代码
历史
←
原代培养
因为以下原因,您没有权限编辑本页:
您所请求的操作仅限于该用户组的用户使用:
用户
您可以查看和复制此页面的源代码。
[[原代培养]]是指直接从机体取下[[细胞]]、组织和器官后立即进行培养。因此,较为严格地说是指成功[[传代]]之前的培养,此时的细胞保持原有细胞的基本性质,如果是正常细胞,仍然保留[[二倍体]]数。但实际上,通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为[[原代细胞培养]]。最常用的原代培养有组织块培养和分散[[细胞培养]]。 ==基本介绍(primary culture)== 原代培养也称初代培养,严格的说即从体内取出组织[[接种]]培养到第一次传代阶段,但实际上,通常把第一代{{百科小图片|bk82i.jpg|原代培养}}至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动,可见细胞分裂,但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是[[异质]]的(Heterogeneous),也即各细胞的遗传性状互不相同,细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞,在[[软琼脂培养]]基中进行培养时,细胞克隆形成率(Cloning Efficiency)很低,即细胞独立生存性差。克隆形成率即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时,形成细胞小群(克隆)的百分数。初代培养细胞多呈二倍体[[核型]];由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大,是检测药物很好的实验对象。 也称初代培养,即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段,一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动,可见细胞分裂,但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的(Heterogeneous),也即各细胞的遗传性状互不相同,细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞,在软琼脂培养基中进行培养时,细胞克隆形成率(Cloning Efficiency)很低,即细胞独立生存性差。克隆形成率即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时,形成细胞小群(克隆)的百分数。初代培养细胞多呈二倍体核型;由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大,是检测药物很好的实验对象。 ==分类== 最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。{{百科小图片|bk82j.jpg|原代培养}}组织块培养是将剪碎的组织块直接[[移植]]在[[培养瓶]]壁上,加入[[培养基]]后进行培养。 分散细胞培养则是将组织块用机械法或[[化学]]法使细胞分散。如欲从[[胎儿]]或[[新生儿]]的组织分离到活性最好的游离细胞,经典的方法是用[[蛋白水解酶]](如[[胰蛋白酶]]和[[胶原酶]])[[消化]]细胞间的[[结合物]],或用[[金属离子]][[螯合剂]](如EDTA)除去细胞互相粘着所依赖的Ca2+,再经机械轻度振荡,使之成为单细胞。 ==实验== <b /> ===实验目的=== 能独立地进行细胞的原代培养,争取原代培养一次成功。{{百科小图片|bk82k.jpg|原代培养}}<b /> ===实验原理=== 细胞培养是[[生物学]]和医学研究最常用的手段之一,可分为原代培养和[[传代培养]]两种。原代培养是直接从生物体获取细胞进行培养。由于细胞刚刚从活体组织分离出来,故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、[[代谢]]、繁殖提供有力的手段,同时也为以后传代培养创造条件。利用此方法还可直接服务于临床实践。例如,用从手术中切除的[[肿瘤细胞]]进行原代培养,然后用该培养细胞进行[[抗癌药物]]的筛选,根据肿瘤细胞对加入的[[化疗药物]]的敏感性来帮助选择最有效的[[化疗]]方案,有可能起到增强疗效、降低[[副作用]]的作用。原代培养可分为消化法和组织块培养法,这里统一作介绍。 <b /> ===实验材料和用品=== 材料:培养瓶,[[青霉素]]瓶,小玻璃漏斗,三角烧瓶,平皿,吸管,[[试管]],[[移液管]],[[无菌]][[纱布]],无菌[[眼科剪]],废液缸,血球计数板,蜡盘,手术器械,大头针,[[离心管]]。孕鼠或新生1。4d乳鼠,75%[[酒精]][[棉球]],2%碘酒。 药品:培养基(RPMI1640或DMEM),小牛[[血清]],0.125%胰蛋白酶,Hanks液,75%酒精,双抗(青霉素和[[链霉素]])。 仪器(请参看仪器图库):CO2[[培养箱]].;[[倒置显微镜]],超净台,[[磁力搅拌器]],[[离心机]]。<b />{{百科小图片|bk82l.jpg|原代培养}} ===实验步骤=== 1.取材(以[[胚胎]]小鼠为例):将孕鼠拉[[颈椎]]处死,投入75%酒精浸泡数秒[[消毒]],提出孕鼠控掉酒精,放置于蜡盘中用大头针固定。用手术器械逐层分离[[皮肤]]和[[肌肉]]组织,打开腹腔。注意不同的解剖层次使用不同的消毒器械。最后取出[[双角子宫]]置于无菌平皿内。 2.用Hanks液洗涤3次,剪开[[子宫]]取出胚胎。除去子宫、[[血液]]和[[筋膜]]等组织。 3.用弯头剪把胚胎尽量剪碎,每个组织块小于1mm3。在操作时应尽量将平皿盖半盖住平皿以防空气中尘埃落下污染组织。再用Hanks液洗涤2-3次,自然沉淀。用吸管吸去[[上清液]]。以下可按两种方法进行,即消化法和组织块培养法。 4.若使用消化法,则将组织块放人三角烧瓶内加入10-30mL0.125%胰蛋白酶,37℃磁力搅拌消化20多min。然后加人少量血清终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液,800r/min离心5-10min收集细胞。弃上清,加入带有双抗的培养基,放入培养瓶中培养。{{百科小图片|bk82m.jpg|原代培养}}5.若进行组织块培养,则不做步骤4,加入几滴血清于组织块中,再用弯头吸管将组织块悬液吸起。在一小培养瓶中逐个铺展开,注意将瓶底涂抹均匀。将瓶子翻转倒置后在37℃培养箱内放置2-3h。待组织块微干与瓶壁粘牢后再轻轻将瓶子翻转过来,从边角加入4-5mL培养基,使细胞接触到培养基,放培养箱内继续进行培养。 ==操作要领== ===混匀操作要领=== (1)火焰消毒吸管,用Hanks液冷却和湿润管内壁(这是因为刚分离的组织细胞易粘在管壁上) (2)吸管头插入管底 (3)用吸管反复轻轻吹打组织块 ===器械的使用=== (1)用工作台消毒[[镊子]]取浸泡在酒精中消毒的器械。 (2)器械置无菌干纱布内嚓一下。迅速通过火焰,冷却后使用。 (3)用过的器械置另一加盖的器皿中再消毒。 (4)器械按浸泡消毒的顺序使用。{{百科小图片|bk82n.jpg|原代培养}}(5)各套再消毒器械不可混用。 ===除去组织块多余水分=== 用吸管将组织块推向青霉素瓶一角,然后将有组织块的瓶面翻向上方,吸去流向对侧的多余水分。 注意:多余水分若不除去,会使组织块剪切不细,消化后的细胞悬液清亮(细胞数少),并可见消化液中消化液中有线状或絮状物漂浮。 ===[[细胞计数]]=== (1)用吸管混匀待计数的细胞悬液。 (2)将一小滴细胞悬液从[[盖玻片]]与[[载玻片]]交界部位滴入细胞计数池中。 (3)沉降1分钟,低倍镜下计数血球计数板四大中格的结构完整的细胞,[[小细胞]]团计数为1。 (4)计数时,如果细胞压在格上,则数上不数下,数左不数右。然后按下式计算出每毫升悬液中的细胞数。 (四大中格细胞数/4)*10000=细胞数/毫升 ==注意事项== 一、注意污染 1、严格进行动物皮肤消毒,使用三套器械取材。新生动物皮肤先用2%碘酒液消毒,成年鼠先用3%~5%碘酒液消毒后用75%酒精消毒。 2、严格进行[[无菌操作]],防止[[细菌]]、霉菌、[[支原体]]污染,避免化学物质污染。 3、吸取液体前,瓶口和吸管硬行火焰消毒;吸取液体时,避免俩这碰撞。 4、离心管入台前,管口、管壁应消毒。 5、实验者离开超净台时,要随时用肘部关闭工作窗。 6、使用过的器械用酒精棉球嚓去血污后,移入另一个器皿中继续消毒,在浸泡器械时剪刀口要叉开放,镊子弯头要向下放,并加盖消毒。二、器材使用时既要注意用火焰消毒,又要防止[[烫伤]]、烫死细胞。经火焰消毒后的吸管一定要用Hanks液冷却。 三、超净台内温度、湿度较大,在夏天工作时台内散热更慢,因此进行细胞悬液混匀、接种时,离火焰要稍微远些。 [[分类:生物]][[分类:实验]]
该页面使用的模板:
模板:百科小图片
(
查看源代码
)
返回至
原代培养
。
导航
导航
最近更改
随机页面
Wiki工具
Wiki工具
特殊页面
页面工具
页面工具
用户页面工具
更多
链入页面
相关更改
页面信息
页面日志