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基因诊断与性病/PCR的特点
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{{Hierarchy header}} (一)特异性高:首次报导的PCR所用的[[DNA]][[聚合酶]]是[[大肠杆菌]]的DNAPolymeraseI的Klenow大片段,其[[酶活性]]在90℃会变性[[失活]],需每次PCR循环都要重新加入Klenow大片段,同时[[引物]]是在37℃延伸(聚合)易产生模板—引物之间的[[碱基]]错配、致特异性较差,1988年Saiki等从[[温泉]]水中分离到的水生嗜热[[杆菌]]中提取的热稳定的Taq DNA聚合酶,在[[热变性]]处理时不被[[灭活]],不必在每次循环[[扩增]]中再加入新酶,可以在较高温度下连续反应,显着地提高PCR产物的特异性,序列分析证明其扩增的DNA序列与原模板DNA一致。扩增过程中,[[单核苷酸]]的错误参入程度很低、其错配率一般只有约万分之一,足可以提供特异性分析,选用各型[[病毒]]相对的特异[[寡核苷酸]]引物。PCR能一次确定病毒的多重[[感染]]。如用HPV11和HPV16型病毒引物检测病妇[[宫颈刮片]][[细胞]]可以发现部分病人存在HPV11和HPV16两型的双重感染。 (二)高度敏感:理论上PCR可以按2n倍数扩增DNA十亿倍以上,实际应用已证实可以将极微量的靶DNA成百万倍以上地扩增到足够检测分析量的DNA。能从100万个细胞中检出一个[[靶细胞]],或对诸如病人口液等只含一个感染细胞的[[标本]]或仅含0.01pg的感染细胞的特异性片段样品中均可检测。 (三)快速及无[[放射性]]:一般在2小时内约可完成30次以上的循环扩增,加上用电泳分析。只需3-4小时便可完成,不用分离提纯病毒,DNA粗制品及总[[RNA]]均可作为反应[[起始物]],可直接用临床标本如[[血液]]、体液、尿液、洗液、脱落[[毛发]]、细胞、活体组织等粗制的DNA的提取液来扩增检测,省去费时繁杂的提纯程序,扩增产物用一般电泳分析即可,不一定用[[同位素]],无放射性易于推广。 (四)简便:扩增产物可直接供作序列分析和[[分子克隆]],摆脱繁琐的[[基因]]方法,可直接从RNA或[[染色体]]DNA中或部分DNA已降解的样品中分离目的基因,省去常规方法中须先进行克隆后再作序列分析的冗繁程序。已固定的和包埋的组织或切片亦可检测。如在PCR引物端事先构建一个[[内切酶]][[位点]],扩增的靶DNA可直接克隆到M13,PUC19等相应[[酶切位点]]的载体中。 (五)可扩增RNA或cDNA:先按通常方法用寡脱氧[[胸苷]]引物和[[逆转录酶]]将mRNA转变成单链cDNA,再将得到的[[单链]]cDNA进行PCR扩增,即使mRNA[[转录]]片段只有100ngcDNA中的0.01%,也能经PCR扩增1ng有242[[碱基对]]长度的特异片段,有些[[外显子]]分散在一段很长的DNA中,难以将整段DNA大分子扩增和做序列分析。若以mRNA作模板,则可将外显子集中,用PCR一次便完成对外显子的扩增并进行序列分析。 {{Hierarchy footer}} {{基因诊断与性传播疾病图书专题}}
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