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==免疫细胞分离技术== ===淋巴细胞的分离=== 取肝素抗凝血1m1 加Hanks 液1m1 稀释后,沿管壁徐徐滴流叠加盛有2m1 [[淋巴细胞分离液]]的[[试管]]内(注意勿与分离液混合,然后2000r/min 水平离心20min,管内分为4 层,自上而下依次为[[血浆]],单个核细胞,颗粒白细胞、红细胞(图2-1)。用[[毛细管]]伸至单个核细胞层中(位于细胞分离液与血浆的界面上),沿管壁轻轻吸出全部细胞。然后用Hanks 液洗两次,每次r/min 离心10min,最后用RPMI l640 [[培养液]]将细胞配成2×106/m1 的细胞悬液备用。 ===T 细胞及B 细胞的分离=== 将淋巴细胞悬液通过[[尼龙]]棉柱,B 细胞粘附于尼龙棉上,T细胞则不[[粘附]],先用RPMI l640 培基洗脱尼龙棉柱,流下的细胞悬液含有丰富的T 细胞。然后用力反复挤压尼龙柱、挤出粘附在尼龙棉上的B 细胞,并用少量的RPMI l640 培基洗脱,此细胞悬液含有丰富的B 细胞。尼龙柱(塑料管)的长短和尼龙棉的多少,视分离细胞的多少而定。 ===CD4 细胞及CD8 细胞的分离=== (1)CD4 细胞的分离:将一定量的T 细胞悬液通过一根SephDdexC—10 柱,然后用少量的RPMll640 培养洗涤,收获的细胞悬液约含85%的CD4 细胞。 (2)CD8 细胞分离:用Tris [[缓冲液]]稀释羊抗鼠IgG(浓度为10μg/m1)包被一平皿表面,然后放置4℃过夜,没有包被上的抗体用PBS 洗净。然后将已标记有抗CD8 [[单克隆抗体]]的T 细胞(细胞浓度为1×l07/m1)3m1 加入上述的平皿内,4℃放置2 小时,用PBS 轻轻洗净末粘附的细胞,然后用毛细管加入10m1 PBS 吹打。收集的脱落细胞经洗涤后悬浮在RPMI l640 培基中备用。CD4 细胞亦可用此法分离。 ===单核巨噬细胞的分离=== 单核巨噬细胞有粘附塑料或玻璃表面的特性,而淋巴细胞则无此特性,借此可将这两类细胞分开,其方法简述如下。将待分离的细胞悬液(如实物动物的腹腔液)加入适当大小的塑料或玻璃平皿内,置于37℃ C02 温箱内[[温育]]1 小时,然后用RPMI 1640 培基轻轻漂洗平皿表面,去除非[[粘附细胞]],再将粘附有细胞的平皿表面用上述培基轻轻洗刷,收集粘附的单核巨噬细胞。如果要获得纯度较高的单核巨噬细胞,可重复上述过程。
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