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{{百科小图片|bkebs.jpg|}} '''内切酶'''(incision enzyme),即[[限制性核酸内切酶]]。亦称限制性核酸酶。 这是一类能从DNA[[分子]]中间水解[[磷酸二酯键]],从而切断双链DNA的[[核酸]][[水解酶]]。它们不同于一般的[[脱氧核糖核酸酶]](DNase),它们的切点大多很严格,要求专一的[[核苷酸]]顺序{{百科小图片|bkebt.jpg|}}——识别顺序。长期以来,难以深入研究的DNA大分子,借此可以切割成特定的小片段来分析。限制性核酸酶的发现,为[[基因]]结构、DNA[[碱基顺序]]分析和[[基因工程]]的研究开辟了途径。为此,W.阿尔伯,H.史密斯和D.内森斯三人共同获得了1978年诺贝尔生理学或医学奖。 一种能[[催化]][[多核苷酸]]的链断裂的酶,只对[[脱氧核糖核酸]]内一定[[碱基]]序列中某一定位置发生作用,把这位置的链切开。通过<b>内切酶</b>可以把某一个遗传基因切下来,若再连在别的[[细胞]]的遗传基因上,便可使这细胞具有新的遗传特性。内切酶的发现和采用,使基因工程成为可能。 ==内切酶的分类== 内切酶主要分成三大类。第一类内切酶能识别专一的核苷酸顺序,并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链,但是切割的核苷酸顺序没有[[专一性]],是随机的。这类[[限制性内切酶]]在DNA[[重组]]技术或基因工程中没有多大用处,无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。 第二类内切酶能识别专一的核苷酸顺序,并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。所以总能得到同样核苷酸顺序的DNA片段,并能构建来自不同[[基因组]]的DNA片段,形成杂合DNA分子。因此,这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸,少数也有识别5个核苷酸以及7个、9个、10个和11个核苷酸的。如果识别位置在DNA分子中分布是随机的,则识别4个核苷酸的限制性内切酶每隔46(4096)个核苷酸就有一个切点。人的[[单倍体]]基因组据估计为3×199核苷酸,识别4个核苷酸的限制性内切酶的切点将有(3×109/2.5×102)约107个切点,也就是可被这种酶切成107片段,识别6个核苷酸的限制性内切酶也将有(3×109/4×103)约106个切点。 第二类内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序,即有一个中心对称轴,从这个轴朝二个向“读”都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式。一是交错切割,结果形成两条[[单链]]末端,这种末端的核苷酸顺序是互补的,可形成氢键,所以称为[[粘性末端]]。如EcoRI的识别顺序为: ↓ | 5’……GAA | TTC……3’ 3’……CTT | AAG……5’ | ↑ 垂直虚线表示中心对称轴,从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG,这就是回文顺序(palindrome)。实线剪头表示在双链上交错切割的位置,切割后生成5’……G和AATTC……3’、3’……CTTAA和G……5’二个DNA片段,各有一个单链末端,二条单链是互补的,可通过形成氢键而“粘合”。另一种是在同一位置上切割双链,产生平头末端。例如HaeⅢ的识别位置是: ↓ 5’……GG↓CC……3’ 3’……CC↓GG……’ ↑ 在箭头所指处切割,产生的两个DNA片段是: 5’……GG CC……3’ 和 3’……CC GG……5’ 有时候两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同,差别只在于当识别顺序中有[[甲基化]]的核苷酸时,一种限制性内切酶可以切割,另一种则不能。例如HpaⅡ和MspⅠ的识别顺序都是5’……GCGG……3’,如果其中有5’-[[甲基胞嘧啶]],则只有HpaⅡ能够切割。这些有相同切点的酶称为同切酶或[[异源同工酶]](isoschizomer)。 第三类内切酶也有专一的识别顺序,但不是对称的回文顺序。它在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则是任意的。因此,这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段,具有各种单链末端。这对于克隆基因或克隆DNA片段没有多大用处。 ==内切酶用于克隆PCR== 克隆PCR产物的方法之一,是在PCR产物两端设计一定的[[限制酶切]][[位点]],经酶切后克隆至用相同酶切的载体中。但实验证明,大多数[[限制酶]]对裸露的[[酶切位点]]不能切断。必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基,才能使所定的限制酶对其[[识别位点]]进行有效切断。 酶切位点(内切酶的识别序列)要加在[[引物]]的5'端,为保证PCR产物能被限制性内切酶的识别且有效的酶切,一般在引物的5'端酶切位点侧边加上保护碱基。 具体为:5'-保护碱基+酶切位点+引物序列-3' 详细可参见,如下图: [[分类:生物化学]][[分类:基因]][[分类:细胞生物学]][[分类:遗传学]]
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