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医学微生物学/细菌的突变
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{{Hierarchy header}} 遗传型[[变异]]中常见的一种为[[突变]](Mutation),即[[细菌]]的[[基因]]结构发生偶然的改变。一般突变会导致所编码[[蛋白质]]的改变,从而使细菌出现新的特性或失去原有的某些特性。细菌的[[自然突变]]率与其[[生物]]的自然突变相同,每106~108次[[细胞]]分裂发生一次。由于细菌每20~30分钟分裂一代,故[[突变株]]相对较多。当突变发生在[[DNA]]一对或少数几对[[碱基]]引起改变时,称为[[点突变]]。这类突变涉及[[碱基对]]的置换、增加或缺失。另一种类型的突变涉及大段DNA的改变如插入或缺失几百个碱基对,称为[[染色体畸变]]。在细菌中点突变较多见,但在[[大肠杆菌]]的[[染色体]]中曾发现有800~1400碱基对的插入,称为插入顺序(Insertion sequences)。 == 一、突变与选择== 由于细菌的突变所发生的[[表型]]变异必须在一定外界环境下才表现出来,因此对外界环境在突变中的作用曾发生过争议。曾有学者认为细菌与其他生物一样,需经过突变与外界环境条件选择而出现突变株;然而也有学者认为细菌生长繁殖迅速,外界环境可直接作用诱导出[[变异株]]。这一争论直到1943年Luria与Delbruck进行了有名的变异试验(Fluctuation test)后才初步获得解决。变异试验是根据[[统计学]]原理设计的(图5-1)。将一瓶对[[大肠杆菌噬菌体]]T1敏感的[[细菌培养]]后,稀释至1,000细菌/ml,分别分至两套[[试管]]系列。一套仅将[[细菌接种]]至一支大管[[培养基]]中,经一段时间培养后,分别[[接种]]于数个平板。在平板中加入[[噬菌体]],(如果出现耐噬菌体裂解的突变细菌株则在该平板上应出现[[菌落]])以筛选耐噬菌体的突变株菌落。另一套试验为将细菌分别接种于数支小试管的培养基,经过一段时间后自每支试管吸取菌液各涂布接种一个加入噬菌体的平板,然后计数发生的突变耐噬菌体[[菌株]]菌落数。如果出现耐噬菌体菌株是因接触噬体而诱导产生的,两套平权上出现的耐噬菌体菌株菌落数。如果出耐噬菌体菌株是接触噬体而诱导产生的,两套平权上出现的噬菌体菌落数应大体相等。如果系细菌[[自发突变]]则两套平板上的耐噬菌体菌落数应有显著不同,因为在后一情况下,细菌分别在各支试管中各自在生长繁殖周期或早或迟可发生突变。突变发生早的突变株繁殖后出现的[[子代]]数必然多于突变株发生晚者,因此各平板上的菌落有的很多,有的则缺如。实验结果证明两套平板上耐噬菌体菌落数差异很大,从万里证实细菌已自身发生为,而外界是条件仅起选择作用。 {{图片|gu574nxd.gif|细菌的变异试验}} 图5-1 细菌的变异试验 然而,仍有学者对上述实验的统计学意义特异议。1952年Lederberg设计了影印培养(Replica plating)(见图5-2),这一试验证明细菌[[耐药]]突变不是由[[抗菌药物]]诱导师产生,而在未接触抗菌药物前已产生耐药突变。其方法为将对[[链霉素]]敏感的大肠杆菌大量接种于[[营养琼脂平板]]上,培养后细菌在培养基上均匀的长出菌苔层,然后用[[灭菌]]的丝绒复盖在一块与平皿同样大小的木块上轻轻影印,使细菌菌落全部转移到丝绒面上。另取含有链霉素的[[琼脂]]培养平板,将丝绒面再印在其上,从而获得与原始平板完全相同的复制平板。将此平板培养,耐药的菌落出现后,通过比较,可从原始平板的相应部位刮取菌苔转种至液体培养基中,增菌后,重复制备原始平板与影印平板。经过数次重复后,则可获得一株完全没有接触过链霉素的高度耐链[[毒素]]的突变株,表现为原始平板上全部菌落与含链霉素平板上的菌落吻合。这一实验雄辩地证明了链霉素仅起选择作用。 == 二、[[基因突变]]类型== 在明确了细菌培养环境条件仅起选择作用后,学者们采用了一些选择方法以获得突变株,这些突变株的应用对研究遗传变异及开展有[[基因工程]]都很有帮助。大从数利用的突变型均为大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏菌,因这两种细菌营养要求不高,仅需盐、微量[[金属离子]]及有限的氮、碳来源即可生长繁殖。未发生突变的菌株称为[[野生型]],而发生突变的菌株则根据选择条件可分为: 1'''.营养缺陷型''':突变后因某种酶的缺失需要额外添加某种营养成份方能生长繁殖者。一般用“+”代表能利用自然存在的某种成份或能合成某种成份的中间体,而“—代表不能合成该成份的菌株。如his-则代表[[组氨酸]]缺陷型,需在培养基中加入组氨酸。 '''2.抗性突变型''':一般以S代表对[[化学]]药物或[[抗生素]]敏感,r代表有抵抗力。如str8代表该菌株对链霉素敏感,在有链霉素存在时不能生长。这类突变型最易获得,应用亦广。 '''3.发酵阴性突变型''':突变后失去发酵某种糖的能力但仍能利用其他糖做为碳源。这是由于突变后失去能分解该糖的酶。由于[[乳糖]]发酵可用指示剂根据pH改变而显示,故可Lac-(乳糖发酵阴性)突变株作为研究工具。 {{图片|gu574qh8.gif|细菌影印培养试验}} 图5-2 细菌影印培养试验 {| class="wikitable" |- | | 1.从普通培养基上将皿上长的细菌,用丝绒影印至含链霉素培养基上,耐菌细菌不多。 |- | | 2.从不接触链霉素的平皿上,按影印显示耐链霉素菌落区挑取细菌增菌。 |- | | 3.将102细菌接种普通培养基上再作影印,再按耐链霉素平皿上相应菌落处接种增菌。 |- | | 4.未接触链霉素的平皿上,全部细菌均耐链霉素。 |} '''4.[[条件致死]]性突变型''':在某一条件下具有致死效应,突变株不能生长,但在另一没有致死效应的条件下仍可生长。最常用者为温度敏感性突变型。它们在[[亲代]]能生长的温度范围内特别是较高湿度(42℃)不能生长,但在较低温度(25℃)则能生长。这种菌株称为ts株。其发生的原因是某些酶的肽链结构发生改变后,降低了酶的抗热性。因此在较高温度下不能生存。这种用温度筛选突变株的方法比较简便,应用较多。 == 三、基因突变的[[分子]][[生物学]]基础== 细菌的基因结构发生改变的机制包括: '''1.[[碱基置换]]'''(Substitution):包括两种类型:转换(Transition)是由嘌呤置换嘌呤或[[嘧啶]]置换嘧啶。[[颠换]](Transversion)是指嘌呤置换嘧啶或嘧啶置换嘌呤。如碱基置换发生于编码[[多肽]]的区,则因可影响[[密码子]]而使[[转录]]、翻译[[遗传信息]]发生变化,因此可以出现一种[[氨基酸]]取代原有的某一种氨基酸。也可能出现了终止密码而使多肽链合成中断,不能形成原有的蛋白质而完全失去某种生物学活性。 '''2.碱基的减少、增加与倒置''':三种情况都可造成对密码的错误阅读。如DNA原有[[碱基顺序]]为AAG,GAA,CGC,TGA,如失去第一个A,则成为AGG,AAC,GCT,GA,使原来编码押肽由亮一组一丙一[[苏氨酸]]改为半胱-亮-精-[[亮氨酸]]。这种突变导致的是密码意义的错误,称为[[移码突变]]。移码突变的影响范围自突变点起直到末端整条[[结构基因]]的转录与翻译,引起[[基因产物]]的变化比较严重,对生物活性的影响也较显著。 '''3.碱基的[[互变异构]]''':四种碱基中的任何一种均可发生互变异构,在作为模板时可引起[[互补碱基]]的改变。如当[[胸腺嘧啶]]以正常形式(即酮基型)为模板时,配对的互补碱基为[[腺嘌呤]];当前者变为[[烯醇]]型结构时,通过氢键配对的碱基可变为[[鸟嘌呤]]。(图5-3) {{图片|gu574t0c.gif|碱基的互变异构}} 图5-3 碱基的互变异构 细菌自发突变的发生原因可能是宇宙间普遍存在的短波[[辐射]]、热及自然界存在的一些具有[[致突变作用]]的物质。人工应用理化因素可[[诱发突变]]者称为[[诱变剂]]。化学诱变剂包括[[核苷酸]]碱基的类似物如分子结构类似胸腺嘧啶的5-[[溴尿嘧啶]]。[[烷化剂]]可改变碱基的化学结构也是诱变剂。[[吖啶]]类染料可螯合入DNA的碱基对之间,引起DNA在复制过程中出现碱基对的插入或缺失。[[紫外线]]与[[X线]]是常用的[[物理]]诱变剂。紫外线可使邻近的胸原嘧啶构成双体,引起DNA结构的变化而致突变。 {{Hierarchy footer}} {{医学微生物学图书专题}}
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