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基因诊断与性病/巨细胞病毒感染症
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{{Hierarchy header}} [[巨细胞病毒感染]]是[[感染]]人类[[巨细胞病毒]](human cytomlegalovirus,HCMV)的一种[[全身感染]][[综合征]]。因被感染[[细胞]]变大,核内和胞浆内出现[[包涵体]],故本病又称[[巨细胞包涵体病]](Cytomegalic inclusion disease,CID)。[[巨细胞病毒感染症]]可分两种类型,一种是[[唾液腺]][[病毒]]症,是无症状限局性感染,婴幼儿较常见;另一种是全身感染,主要侵犯[[婴儿]],比较少见。但由于性俗的改变,成人由性行为感染此类病毒在西方国家较为常见,故已归为性传播性[[疾病]]。 ==第一节 [[病原学]]== CMV属于[[疱疹]]病毒群,是人类疱疹病毒组中最大的一种病毒,其形最大由162个[[壳粒]](capsomer),正20面体构成。有典型的疱疹病毒结构。CMV只能在人纤维[[母细胞]]培养中[[增殖]],而不能在其他[[动物细胞]]中生长,增殖非常缓慢,初次分离需一个多月才能出现特殊的细胞;细胞变园,[[膨胀]],细胞及核巨大化,核周围出现一轮“晕”的大型嗜酸性包涵体。 CMV在20%[[乙醚]]中最多存活2小时。pH&lt;5时,或置于56℃30分钟,或[[紫外线]]照射5分钟可被充分[[灭活]]。CMV的[[感染性]]对冻融或存于-20℃或-50℃均不稳定,10%的家用[[漂白粉]]可使其感染性明显降低。 ==第二节 CMV[[基因组]]结构== CMVDNA为线性双链[[分子]],约235-240kb,长度为56-76nm,其[[分子量]]为150-160×103KDa,不同种属的CMv [[DNA]]分子量基本相同。各毒株DNA有80%[[同源]]序列,通过限制性[[酶谱]]可区分不同毒株。CMV与其他疱疹病毒一样,具有1个长的[[单一序列]](UL)及1个短的单一序列(US)。UL和US的相连处及两端均为DNA[[重复序列]]。UL约115×103KDa,约占16%。UL两端的两个[[反向重复序列]]约占90%;US两端的两个反向重复序列约占2%。由于UL及US可以两种方向存在,则CMv DNA具有4种分子异构型,但除人类巨细胞病毒(HCMV)及鼠CMV外,其它动物CMV无异[[构型]]存在。CMvDNA只有一个单向性的IE[[启动子]][[复合体]],其可指导多个[[基因]]的表达。CMV基因组至少能编码[[氨基酸残基]]数100以上的[[多肽]]200余种,包括原始[[基因产物]],中间产物及终未产物。 巨细胞病毒基因组的重复序列对其复制、[[基因表达]]方向以及与细胞相互作用的方式可能有重要意义。用[[核酸外切酶]]处理双链巨细胞病毒DNA可形成[[粘性末端]]而接连成环状,这一特点可能与该病毒的转化作用和潜在的致癌性有关。 ==第三节 感染途径== CMV感染在全世界分布,人是CMV的唯一[[宿主]]。不同国家及不同经济状况[[感染率]]不同。成人CMV感染和[[免疫功能]]有密切关系。如因[[器官移植]]而接受[[免疫抑制剂]]治疗者,常因所供器官和输入[[血液]]中有潜伏病毒,或[[免疫抑制]]使潜伏的病毒[[活化]]而发病,[[艾滋病]]患者的CMV感染[[发病率]]高。 [[传染源]]是病人及其急性带毒者,病毒可由乳汁、[[唾液]]及尿排出,可持续数周到几年,人类易于感染,[[传播途径]]多种多样。属于性传播性疾病。多从[[精液]],宫颈分泌物,泪液及粪便([[口腔]]性欲,吻肛)感染所致。(见表1) [[同源性]]CMV感染是[[输血]]和器官移植的一种严重危害,多次输血或一次大量输血使原发和再发感染的危险性增高,输入含[[白细胞]]血液的危险性更高,器官或[[骨髓移植术]]后CMV感染率也高。 CMV感染途径(环)表 表1 {| cellspacing="4" cellpadding="1" align="center" | {{图片|glnotvht.jpg|}} |- | align="center" valign="top" | |} 第四节 发病机理 初次感染后,CMV将在宿主细胞中无限期存在成潜伏状态。可能累及多种组织器官,[[尸检]]提示肺、肝、胰、唾液腺、[[中枢神经系统]]及肠也可能是病毒潜伏场所。先天性感染的严重程度,与缺乏产生沉淀[[抗体]]的能力和T细胞对CMV的应答有关。儿童和成年人感染CMV后,在外周血中出现具有[[抑制细胞]]毒[[表型]]的活化T[[淋巴细胞]],如果宿主的T细胞功能受损,潜伏的病毒就可能复活并引起多种症候群。[[组织移植]]后发生的慢性刺激,为CMV活化,诱发疾病提供了条件。某些针对T细胞的强烈免疫抑制剂如[[抗胸腺细胞球蛋白]],与临床CMV症候群高发率有关。此外,CMV在功能上可作为辅助因子,使潜伏感染的[[HIV]]活化。 ==第五节 [[免疫学]]== CMV感染可引起机体的免疫功能降低,特别是[[细胞免疫]]功能下降。CMV感染对[[胸腺]]发育及[[脾细胞]]、[[单核吞噬细胞]]、NK细胞及CTL细胞的功能有着显着的影响。 '''一、对胸腺、[[脾脏]]的影响''' 实验室急性CMV感染的新生豚鼠,胸腺发育受抑,T细胞数减少,成年鼠感染CMV后,88%胸腺可检出CMV。 CMV感染致脾功能受影响,脾脏淋巴细胞对conA刺激的增殖下降,脾细胞产生的IL-2显着降低。 '''二、对[[免疫细胞]]的影响''' CMV感染引起的免疫抑制与病毒在细胞内的复制有关。CMV可以在单核吞噬细胞、T细胞、B细胞及一些尚未确定的[[单核细胞]]中复制,其中单核吞噬细胞最易感染CMV,淋巴细胞在[[免疫反应]]中具有重要的调节功能和效应功能。CMV感染后,可引起淋巴细胞的多种免疫功能受损。 CMV感染多表现为急性单核细胞增多症。外周[[血淋]]巴细胞对[[有丝分裂]]原、CMV[[抗原]]和HSV抗原增殖反应减弱,诱导[[干扰素]]水平下降,CD4/CD8比值从1.7±0.7下降为0.2+0.2,T细胞活性降低.这种变化有的可持续相当长时间,病后10个月,大多数患者T细胞[[亚群]]比例仍未完全恢复正常。 CMV感染的免疫抑制作用主要是被[[病毒感染]]的大单核细胞和CD8细胞的功能异常所致。单核吞噬细胞在抗CMV[[免疫]]中起着枢纽作用,不但可以直接吞噬、杀伤病毒,更重要的是可以处理、提呈抗原,[[分泌细胞]]因子,调控和扩大免疫反应。当CMV感染后,单核吞噬细胞功能受到影响,CMV感染[[巨噬细胞]]引起其吞噬功能降低,细胞内[[氧自由基]]产生减少,FC[[受体]]、[[补体受体]]的表达发生改变,且其抗原提呈功能降低,产生IL-1降低,对IL-1及IL-2的反应亦降低。Moses等用[[胸腺细胞]]增殖试验检测,IL-1活性降低,IL-1产生降低可引起TH/TS细胞比例失衡。 NK细胞有[[拮抗]]CMV扩散的作用。NK细胞积极参与了抗CMV感染的全过程,但存在高的NK活力不一定是保护性应答,而是活动性感染的证明。NK细胞虽不能阻止[[原发性]]CMV感染的出现,但一旦存在感染后,NK细胞能在CMV感染早期出现,有限制扩散、使感染局限的作用。NK细胞、CTL细胞是抗CMV的重要[[效应细胞]]。在CMV复制早期,感染性病毒体产生前,它们能裂解感染细胞,使病毒在细胞间扩散[[流产]]。在小鼠模型中,病毒作用了3-5天时,抗病毒效应由NK细胞介导,NK细胞活性可由IFN增强。6-21天,脾、外周血存在CTL细胞的杀伤活性。NK细胞、CTL细胞活性的高低决定了机体对CMV感染的敏感性及感染恢复的难易性。但CMV感染时,NK细胞及CTL细胞活性亦受到严重影响。此外,特异性细胞免疫有阻止CMV感染再发作用。有人检测了20个发生CMV感染[[肾移植]]受者T细胞应答,发现有14个有CMV[[细胞毒]]应答,而6个不出现细胞毒应答者有严重的临床后果。因此,特异性T细胞存在,有阻止CMV感染再发的作用。 '''三、抗体有降低CMV感染的[[毒力]]作用''' 机体受CMV的感染后,可出现多种抗体。乳汁、宫颈分泌物、唾液中尽管有[[特异性抗体]]出现,包括[[中和抗体]]。但仍能检出CMV,说明抗体并不能阻止病毒扩散。[[胎儿]]从母体被动获得的抗体不能阻断经宫内、产道或乳汁传播的感染。研究证明,致死性CMV攻击前,在小鼠腹腔或[[静脉]]注入0.2ml高效价抗CMV[[球蛋白]],可完全保护动物免于死亡。1个月后再用CMV等二次攻击,动物仍全部存活,表明抗体有降低CMV的毒力作用。 ==第六节 [[临床表现]]== CMV感染的自然史很复杂,在原发性感染以后排毒,往往持续数周、数月甚至数年,然后感染转为潜伏。常有复发感染伴重新排毒。甚至在原发感染后很多年,潜伏病毒再激活,也可能有不同[[抗原性]][[病毒株]]的再感染。CMV感染的临床表现与个体免疫功能和年龄有关。从表2所示,不论从[[垂直感染]]、平行传播或[[医源性感染]]所出现的[[症状]]与[[体征]]都是多种多样的。 表2 CMV[[感染症]][[临床经过]]与病型(Baerlocher等) {| class="wikitable" | 1.新生儿感染(先天性)<br /> a.重症型:[[黄疸]]、[[贫血]]、[[肝脾肿大]]、[[血小板减少性紫癜]],侵犯中枢神经,[[肺炎]],[[心肌炎]])<br /> b.轻症型:[[假死]],[[心脏肥大]],高[[胆红素血症]] |- | 2.出生后[[无症状期]],乳儿期再感染CMV(先天性/后天性?)<br /> a.全身型<br /> b.[[呼吸]]系型([[百日咳]]样)c.肝脾肿大<br /> d.胃肠型<br /> e.肾型?<br /> 3.后天型<br /> a.[[流感]]型<br /> b.[[单核细胞增多症]]型<br /> c.呼吸系型<br /> d.胃肠型<br /> e.[[肝炎]]<br /> f.因特殊医疗防御能力低下<br /> g.无症型? |- | 4.1、2、3项的后果即精神、运动[[发育迟缓]] |} 关于后天性CMV感染症,在临床中常见于输血后的单核细胞增多症,由于免疫功能缺陷而发生[[血管]]、[[网膜炎]]、肺炎以及[[消化道感染]]。并且大多数患者合并格-巴氏综合征。 ==第七节 诊断== 单靠临床表现不能诊断CMV感染,从临床[[标本]]中分离出病毒,同时抗体呈出4倍以上增加或持续[[抗体滴度]]升高,将有助于诊断。 一、病毒分离 最好用唾液、尿液、[[生殖]]道分泌物、乳汁和白细胞,[[接种]]到人的[[成纤维细胞]]内繁殖和分离,细胞病变效应(CPE)在1天或数周后出现,经固定和HE[[染色]]后可观察到[[巨细胞]],核内有内包涵体,核周晕圈及嗜酸性胞浆内包涵体,很象“猫头鹰眼”(owl′s eye)亦可用单克隆或[[多克隆抗体]]的荧光染色等方法检查。 二、[[血清抗体]]检测 最常用的有[[补体结合试验]](CF)、间接免疫荧光试验(IIF)、免疫酶试验(EIA)、[[间接血凝试验]](IHA)和放射免疫试验(RIA)等检测CMV-IgG和IgM抗体。当单份[[血清标本]]已确定既往有CMV感染时,应当立即留血清标本,以及间隔2周、4周、8周再留血清标本,结合病毒分离可作原发感染诊断。 三、DNA[[探针]] 已广泛应用于检测CMV,其中以32P标记的探针敏感性最高,对某些标本来说,杂交方法可能比病毒分离更敏感。 四、[[聚合酶链式反应]](PCR) (一)标本的采集及处理 采集的标本包括患者的血液、尿,以及腺体组织等。由全血制备的[[血沉]]棕黄层(buffy coats)可保存于-80℃;尿液标本可保存于液氮中。冻存标本应避免反复冻融。 尿液标本经2500r/min离心10min,以除去细胞碎片,收集[[上清液]]。由于尿液中含有PCR[[抑制剂]],因此需用[[聚乙二醇]](PEG6000)进行[[预处理]]:50μl尿上清与50μl 20%PEG6000和25μl 2mol/L NaCl混合,置冰浴中6h;15000r/min离心30min收集沉淀。再于6400r/min离心3min;尽可能吸去上清,将沉淀悬浮于[[蒸馏水]]中。该悬液可直接用于PCR[[扩增]];扩增时应于100℃加热10min,迅速置冰浴中冷却。 (二)模板DNA的制备 1.由[[血液标本]]制备模板DNA 方法A:向[[血清]]中加入NaCl使最终浓度为150mmol/L;取10μl 此血清于70℃处理45s后即可直接进行PCR扩增。 方法B:由血沉棕黄层(BCP)制备:① 用PBS洗涤BCP两次,收取沉淀。②加入500μl 6mol/L[[盐酸]]胍,[[匀浆]]。③ 加入30μl 10mmol/l EDTA,10mmol/L NaCl,30μl20% Sarcosyl和5μl [[蛋白酶]]K(10mg/ml),混合均匀,60℃反应1h。④加入1130μl 的[[乙醇]],-20℃沉淀1~2h。⑤ 离心收集DNA沉淀。⑥用70%乙醇洗两次,最后将沉淀悬浮于少量10mmol/L Tris-HCl,1mmol/l EDTA中。置4℃备用。 2.由冰冻组织标本制备模板DNA:①用恒冷[[切片机]]切取一块~10μm冰冻组织块,置于1.5ml塑料管中。②加入10%用[[缓冲液]]配制的福马林。③ 10min后离心1~2min轻轻倾去上清液,沉淀用乙醇洗2次。④于室温干燥10~60min。⑤ 加入抽提缓冲液(100mmol/L Tris-HCl,4mmol/l EDTA、pH8.0,400μg/ml蛋白酶K),使刚好浸没沉淀物(约50~100μl);将沉淀捣碎。福马林固定的或[[石蜡]]包埋组织经脱蜡和干燥后也可按此处理。⑥37℃放置过液。⑦ 置沸水中7min灭活蛋白酶K。⑧离心收集上清,取1~10μl 即可进行PCR扩增。 3.由尿液标本制备模板DNA:①100μl 尿上清液与100μl 6mol/L异硫氰酸胍,7μl 2mol/LNaCl和20μl 玻璃粉悬液(DNa PREP,Asahi Glass Co,Tokyo)混合。② 室温放置10min后,6400r/min离心2min,收集沉淀。③沉淀用50%乙醇,10mmo/L Tris-HCl、pH7.4, 50mmol/L NaCl洗一次,6400r/min离心1min。④同样洗涤沉淀2次,收集沉淀。⑤ 加入50μl 蒸馏水,于55℃作用15min。⑥15000r/min离心2min,收集上清(含HCMV DNA),进行PCR扩增,将此悬液于100℃加热10min,并迅速于冰浴中冷却。 (三)[[引物]]及探针 引物及探针的设计是根据已发表的CMV的直接早期[[蛋白]]基因的启动子区和开始的4个[[外显子]]序列、晚期抗原gp64基因以及[[磷酸]]化蛋白pp71基因序列。常用的引物和探针列在表3中。 (四)PCR扩增步骤 1.10×反应缓冲液:100mmol/LTris-HCl、pH8.4,500mmol/l KCl,25mmol/L MgCl2,2mg/ml[[明胶]]。 Taq DNA [[聚合酶]]:5U/μl 。 10×dNTP:4种dNTP各2.0mmol/L。 引物:100pmol/L。 2.常规PCR扩增 10×反应混合物(50μl)反应缓冲液 5μl 10×dNTP 5μl 模板DNA 5μl Taq DNA聚合酶 0.2μl (IU) 引物 各0.5μl 蒸馏水 3.8μl 加1~2滴矿物油。 将反应混合物于94℃加热5min;然后于95℃ 30s,55℃40s,72℃ 60s,扩增35~40循环。 表3 CMV PCR扩增所用的引物及探针 {| class="wikitable" | 引物及探针 | 序列(5′→3′) | 位置 | 片段大小 |- | IE1 | CCACCCGTGGTGCCAGCTCC | 早期基因 | 159(bp) |- | IE2 | CCCGCTCCTCCTGAGCACCC | | |- | IE3(探针) | CTGGTGTCACCCCCAGAGTCCCCTGTACCCGCGACTATCC | | |- | LA1 | CCGCAACCTGGTGCCCATGG | 晚期gp64 | 139 |- | LA2 | CGTTTGGGTTGCGCAGCGGG | | |- | LA3(探针) | TTCTTCTGGGACGCCAACGACATCTACCGCATCTTCGCCG | | |- | IE1a | AGATCGCCTGGAGACGCCAT | 早期外显子1 | 139 |- | IE1b | GGAATCCGCGTTCCAATGCA | | |- | IE2a | ATGGAGTCCTCTGCCAAGAG | 早期外显子2 | 72 |- | IE2b | CCGTGGCACCTTGGAGGAAG | | |- | IE3a | GTGACCAAGGCCACGACGTT | 早期外显子3 | 167 |- | IE3b | TCTGCCAGGACATCTTTCTC | | |- | IE4a | ACAGATTAAGGTTCGAGTGC | 早期外显子4 | 179 |- | IE4b | CAATACACTTCATCTCCTCG | | |- | IE4c | TTACCAAGAACTCAGCCTTC | 早期外显子4 | 158 |- | IE4d | GTGCGTGAGCACCTTGTCTC | | |- | IE4e | TATACCCAGACGGAAGAGAAATTCA | 早期外显子4 | 426 |- | IE4f | ATAAGCCATAATCTCATCAGGGGAG | | |- | Pp1a | TAGCGCGCATACATCCCGAGTACAT | Pp71基因 | 316 |- | Pp1b | ATGACGTTGCTCCGTGGAAAGAGACC | Pp71 | |} 3.套式(nested)PCR扩增:①反应混合物的组成同(2),仅引物为IE2a和IE4b(包括了整个外显子3,共721b),各100pmol。于94℃60s,52℃150s,72℃ 480s,扩增20循环。② 取2μl 上述扩增产物,各加100pmol的引物IE3a和IE3b补加其他[[试剂]]。然后,于94℃60s,52℃150s,72℃180s,扩增20循环。 (五)产物鉴定 扩增产物的分析可采用固相(滤膜)杂交和液相杂交试验。 1. 固相杂交: ① 预杂交液为3×SSPE,5×Denhardt,0.5%SDS和25%[[甲酰]]胺.含有扩增产物的滤膜于42℃预杂交30~60min。②加入标记探针(10cpm/μg,2ng/ml),杂交30~60min。③ 用0.2×SSPE,.01%SDS分别于室温洗涤滤膜3次,5min/次;于60℃洗一次,10min/次;再于室温洗一次以上,5min/次。④自显影。 2. 液相杂交及电泳分析: ① 取1/10体积的扩增产物与0.5~1.0pmol末端记的探针混合。②加入最终浓度为150mmol/L NaCl,10mmol/L[[磷酸钠]]及1mmol/L EDTA溶液,使总体积为20μl 。③ 95℃ 10min,然后于56℃ 60min。④ 离心10s加入样品缓冲液,于8%[[聚丙烯酰胺凝胶]]中进行电泳。⑤电泳毕,用溴化乙锭染色,然后对[[X线]]片曝光,自显影。 HCMV DNA分子很大,其[[碱基]]序列尚未全部搞清。虽然它的DNA的[[限制性内切酶]]片段长度具多形性,但是对其基因组的离散性还不清楚。用单一引物对进行PCR扩增,可鉴定90%的HCMV野型分离株;而采用针对不同HCMV序列的两套以上的引物对,则可检测几乎所有的病毒株。因此,可根据情况使用两对或两对以上的位于基因组不同区域的引物进行PCR检测。 在HCMV模板DNA制备过程中,有时会产生一些小片段DNA,在PCR[[反应时]]常导致一定水平的[[本底]]产物,从而影响对结果的判定。在这种情况下可采用套式PCR法,其基本原理就是靶DNA的扩增分为两步:首先利用一对引物,扩增包括靶DNA在内的长片段DNA;然后取少量的扩增产物,利用只针对靶DNA的引物再进行第二次扩增。通过控制每步中的扩增循环数,即可防止由小片段DNA引起的[[假阳性]]。这种方法也可避免产生[[假阴性]]结果。 PCR检测HCMV标本具有很高的敏感性。从HCMV感染的[[组织培养]]上清可检测到相当于几十个病毒的DNA分子或1~5PFU病毒的DNA序列。用非放射性[[寡核苷酸探针]]进行Southern杂交分析扩增产物,可从尿液标本中检测到1pgHCMv DNA序列的水平;利用该系统,在4×104个细胞中只有一个[[病毒基因组]]即可检测出,较斑点印迹杂交提高2×103倍。 PCR技术对HCMV感染的检测具有临床应用价值,因为体液中病毒DNA先于病毒感染的临床症状或[[血清学]]证据的出现,可作为HCMV感染的早期指标。由于HCMV可通过[[胎盘]]内感染、产道感染等途径传播,而且受感染的[[新生儿死亡率]]较高,因此利用PCR进行早期诊断及采取及时的治疗措施,对[[优生优育]]也有重要意义。利用这种方法,还可鉴定器官或组织移植手术中[[供体]]是否为HCMV与许多严重[[病症]]的关系。再者,PCR检测指标稳定,还可进行半定量分析,因此可作为评价各种[[抗病毒药物]]疗效的手段。 ==第八节 治疗== 巨细胞病毒感染的治疗,可应用各种抗病毒制剂如GCV、抗巨细胞病毒的[[免疫球蛋白]]制剂、干扰素及[[转移因子]]等。但这些药物并不能解决根本问题,往往停药后病毒又潜伏地回升,鉴于此种病毒可能作为艾滋病的病因之一,各国学者均在致力于控制其感染的研究。最近,美国学者研制出两种[[活疫苗]],初试后颇见效。一种是由AD169[[菌株]]研制成的;另一种是从TOWn菌株制成的,经非肠道给药后,已明显表现出有抗巨细胞病毒的效能,CMV抗体升高,导致免疫功能增强。 ==参看== *[[巨细胞病毒感染症]] {{Hierarchy footer}} {{基因诊断与性传播疾病图书专题}}
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