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==实验室研究进展== <b>1、PCR检测[[核酸]][[扩增技术]]的应用,尤其是[[广谱]]PCR技术和[[基因]]测序已</b> {{百科小图片|bke6v.jpg|实验室研究}}经成功用于检测和确诊巴尔通体感染。为评估PCR方法的检测效能,SophieW等用特异性[[引物]]对46名临床确诊的CSD病人进行htrA基因的PCR[[扩增]],结果45份扩增出414bp的阳性片断,灵敏度高达98%,特异度100%(41/41)。而Hansmann用同样的引物对临床CSD病人的淋巴标本进行PCR检测,灵敏度仅76%。通过对汉赛巴尔通体16SrRNA编码基因进行分析,可区分出2种不同的[[基因型]]即Houston-1和Marseille型,同时也代表了人类分离株的2种不同的[[血清型]](HoustonⅠ;MarseilleⅡ型)。另外,[[柠檬酸]][[合成酶]]基因(gltA)、16S[[核糖体]]DNA(rDNA)、DNA指纹印迹分析如[[重复序列]][[聚合酶]]联反应(REP-PCR)和[[肠杆菌]]基因间重复序列PCR(ERIC-PCR)等也可用于区分汉塞巴尔通体的2种基因型。Hsp60基因groEL和rpoB的序列[[变异]]可在种水平上区分出汉塞巴尔通体及其2种不同的基因型。Zeaiter等分别用起源于基因间[[隔区]](ITS)、groEL及pap31序列的3对特异性引物对临床确诊的CSD病人的淋巴活检标本进行PCR检测,扩增出3种特异性基因片断,证明ITS引物种属水平上检测巴尔通体,groEL引物则可区分出2种不同的汉赛巴尔通体即Houston-1和Marseille型,而pap31引物则能更详细的区分出4种不同汉赛巴尔通体亚型即Marseille、CAL-1、Houston-1和1种新的[[变异性]]ZF-1。但PCR方法尚存在很大缺陷,如PCR引物结合缺乏特异性,实验室污染等。 2、[[血清学]]方法分离巴尔通体通常既耗时又不易成功,PCR在检测临床样品时可作为一种快速特异的病原检测方法,但需要适当的实验设备和器材。对于许多临床实验室来说,确诊临床可疑CSD最实用的诊断方法是<b>血清学检测</b>。 (1)[[免疫荧光]][[抗体]]检测(IFA)汉赛巴尔通体作为CSD的主要[[致病菌]],主要是依靠IFA的血清学方法进行检测。汉赛巴尔通体易于自动黏附,这种细菌成簇的现象会阻碍产生分散的全菌抗原,血清学检测的灵敏度因不同实验室而异,从100%到30%以下不等,在预测IFA诊断效能的早期报道中,用汉赛巴尔通体IgG≥1∶64的[[滴度]]检测CSD,灵敏度为84%(38/45),特异度为96%(108/112)。另一项研究表明,对于[[临床诊断]]的CSD病例,88%的汉赛巴尔通体IgG≥1∶64,而世界各地的健康人群调查,汉赛巴尔通体抗体阳性率在36%~11%不等。2003年Rolain等用PCR确诊的200名CSD病人血清进行IFA方法的评估,结果发现,其灵敏度86.8%,特异度74.1%,阳性预测值 79.6% 。Michael等用商业化的巴尔通体IgG抗原片(MRL)检测城市和农村人群猫抓病[[血清标本]],灵敏度和特异度分别为84.6%和93.4%。Bergmans等认为,用IFA方法进行检测时,汉赛巴尔通体与Vero[[细胞混合]]培养几天要比[[混合培养]]几小时的灵敏度要高。IFA主要用来检测抗BhenselaeIgG抗体,对抗IgM的检测不理想。另外,来自观察者的变异也影响结果的判断,IFA也不适合自动化操作和大规模样本检测。另外,当用细菌全细胞作为抗原时,则存在[[特异性抗原]]的血清学[[交叉反应]],尤其是与[[五日热]]巴尔通体之间的交叉反应。 {{百科小图片|bke6w.jpg|期待科学的进步}}(2)酶免疫学实验(EIA) 目前,用于巴尔通体酶免疫试验多是用灭活的细菌全抗原和提取的[[外膜]][[蛋白]]抗原。常规的外膜蛋白的制备方法是将巴尔通体[[菌株]]接种在含5%的血琼脂培养基上,在37℃,5%CO2环境中培养1周左右,收集菌落用[[缓冲液]]悬浮、洗涤并离心,56℃30min灭活后,用[[超声波]]粉碎机粉碎并离心除去较大的细胞碎片和[[细胞器]]等,对上清液进行约100000g超速离心1h,取沉淀悬浮于缓冲液中,离心重复3次。最后,取沉淀悬浮于[[蒸馏水]]中即可。用外膜蛋白包被高吸附ELISA板,进行[[酶联免疫]]抗体的测定是国外实验室较常用的方法。Patnaik等用EIA方法检测确诊的CSD病人,其中94%的血清抗汉赛巴尔通体IgG阳性,10%的对照阳性,仅2%的健康献血者中抗汉赛巴尔通体IgG阳性。 猫抓病 (3)血清学检测影响因素几个因素可能会影响血清学检测的灵敏度。首先,灵敏度根据疾病的定义不同而改变。CSD曾被定义为局限性[[淋巴管炎]]伴特征性[[组织病理学]]变化([[肉芽肿]]),有猫[[接触史]]和猫抓的皮肤损伤点,皮肤抗 原检测阳性,并排出其他原因造成的淋巴管炎。 近年来,这些限制性的诊断方法已很少使用,皮肤的抗原检测由于其潜在的健康隐患已逐渐被淘汰,淋巴活检也很少使用。然而,很多抗汉赛巴尔通体抗体水平较高的病人却没有明显的猫接触史,许多病人也没有明显的CSD特征,用上述限制性的定义可能会高估血清学检测的灵敏度。另外,临界值的高低也可影响到血清学灵敏度,Zangwill等报道的灵敏度和特异度分别为84%和90%,若临界值定在1∶512,特异度可高达99%,而灵敏度则下降到64%。巴尔通体菌株在血琼脂培养上进行[[传代培养]],即使是有限的几代,与从猫血中新鲜分离的菌株相比,也能导致菌株[[毒力]]的减弱,从而产生较低的[[抗体反应]]。另外,抗原的制备对结果的影响也很大,同细胞培养菌株相比,用琼脂培养基培养的菌株制备的抗原其A值偏低。另外,抗原变异也可导致较弱的[[抗原抗体反应]]。 血清学方法尤其是IFA,已经是临床及[[实验室诊断]]猫抓病最广泛和实用的方法,但血清学方法不能区分出汉赛和五日热巴尔通体的感染。Sander等报道的猫抓病人中,两者之间的交叉反应高达95%以上。汉赛巴尔通体与Coxiellaburnetii和Chlamydiapsittaci之间也存在较强的交叉反应。在进行[[免疫学]]检测之前,对可能造成交叉反应的抗原进行血清吸收试验,可提高检测效果。 另外,用当地的分离株或混合株作为抗原用EIA和IFA检测可提高[[血清学诊断]]CSD的效果。[[聚丙烯酰胺凝胶电泳]](SDS-PAGE)和[[免疫印迹分析]](westernblotting)也是实验室常用的诊断猫抓病的辅助方法,通过不同的SDS-PAGE蛋白电泳图分析,可区分出不同巴尔通体种属,用无日热巴尔通体、汉赛巴尔通体、杆菌性巴尔通体(Bbacilliformis)及伊丽莎白巴尔通体(Belizabethae)的[[抗血清]]做Westernblotting实验,也能区分出不同的巴尔通体种属和[[亚种]]。一些实验室也用[[斑点杂交]]试验和细胞脂肪酸分析进行猫抓病及巴尔通体感染的辅助检测。 [[分类:疾病]][[分类:宠物]][[分类:病理学]]
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