组织学/电子显微镜术

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1、透射电镜术 透射电镜(transmission electron microscope,TEM)是以电子束穿透样品(组织的超薄切片),经聚合放大后,显像于荧光屏上进行观察和摄片的。电镜的放大倍数的分辨率比光镜大得多,放大倍数为几万至几十万倍,分辨率可达0.2nm。标本制备较光镜的更严格,新鲜组织切成小块(lmm3),用戊二醛多聚甲醛四氧化锇等固定,树脂包埋,以超薄切片机切成厚50~80nm的超薄切片,经醋酸铀和柠檬酸铅等重金属电子染色后,置于电镜下观察,标本在荧光屏上呈黑白反差的结构影像。被重金属浸染呈黑色的结构,称电子密度高(electron-dense);反之,浅染的部分称电子密度低(electron-lucent),这种染色称正染色(positive staining)。若被染结构着色浅淡,而其周围部分染成黑,是称为负染色(negative stainning)。透射电镜的电子枪加速电压50~100kV,电子束穿透力低,近年制成加速电压500kV以上的超高压电镜,电子束穿透力很强,可观察0.5~10μm厚的切片,可观察细胞内骨架等的立体超微结构。应用电镜观察细胞化学染色标本,称电镜细胞化学术(electron microscope cytochemistry);电镜观察免疫细胞化学染色标本,称免疫电镜术(immunoelectron microscopy);电镜与放射自显影结合的方法称电镜放射自显影术(electron microscopeautoradiography)。

2、扫描电镜术 扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)是用于观察组织表面的立体结构的。组织块经固定后,置于真空镀膜仪内于燥,在标本表面先后喷镀一层碳膜和合金膜,即可置于镜下观察。扫描电镜的景深长,样品表面的金属膜可提高其导电性和图像反差,在荧光屏上扫描成像,呈现富有立体感的表面图像,如细胞表面的突起、微绒毛纤毛细胞的分泌与吞噬行为等(图1-13)。

大鼠分离肝巨噬细胞粘着吞噬羊红细胞扫描电镜像


图1-13大鼠分离肝巨噬细胞粘着吞噬羊红细胞扫描电镜像

M肝巨噬细胞,R羊红细胞

冷冻蚀刻标本制备示意图


图1-14 冷冻蚀刻标本制备示意图

细胞单位膜从中间层劈开示意图


图1-15 细胞单位膜从中间层劈开示意图

3、冷冻蚀刻复型术和冷冻割断术

冷冻蚀刻复型术(tfeeze etch replica):是在透射电镜下观察组织或细胞断裂面的金属复制膜,显示细胞微细结构的立体影像。组织块先经甘油生理盐水处理(防止形成冰晶)后投入液氮快速冷冻,在低温下用钢刀将样品劈开,形成凹凸不平的断裂面:-100℃真空下使断裂面的冰晶升华,暴露不平整表面;在断裂面上先后喷镀一层合金膜和碳膜,用次氯酸等组织腐蚀掉;将反差的凸凹不平的金属复型膜置于镜下观察(图1-14)。此项技术尤适用研究生物膜的内部结构,如从单位膜的脂质分子疏水端劈开(图1-15),经蚀刻镀膜,镜下可见质膜断裂面复型膜结构状态(图1-16),其凹凸影像恰与实物相反。

小鼠肾近曲小管微绒毛冷冻蚀刻复型电镜像


图1-16小鼠肾近曲小管微绒毛冷冻蚀刻复型电镜像 ×38300

MV微绒毛 E E面,P P面(白求恩医科大学尹昕、朱秀雄教授供图)

冷冻割断术(freeze cracking):是将固定组织包埋在树脂内,低温下割断,断面喷镀合金,在扫描电镜下观察断面的立体构型。该技术适于研究组织内部微细结构的相互关系,如肝细胞肝血窦胆小管的关系,肾小体的肾小囊与血管球的关系等(图1-17)。

大鼠肾冷冻割断扫描电镜示肾小体


图1-17 大鼠肾冷冻割断扫描电镜示肾小体

R肾小囊外表面,G血管球,T肾小管

(白求恩医科大学尹昕、朱秀雄教授供图)

4、电镜X-射线显微分析术X-射线显微分析术(X-ray microanalysis)是研究细胞和组织内元素的种类、分布和含量的新技术。它是利用高速电子束轰击电镜内生物标本的微小区域,使该区所含的元素发射了一定波长的X-射线,通过检测器对X-射线进行波谱或能谱分析,即可测定微区内元素的性质、含量和分布。如测定细胞内Na、K、Ca、Fe、P、Cl等及某些微量元素的含量和分布变化,探讨各种元素与细胞生理和病理的关系。